Como enviar materiais para diagnóstico

COLHEITA E REMESSA DE MATERIAL NA NECROPSIA
(texto ainda em processo de elaboraçao pelo Professor Doutor Matias Pablo Juan Szabó)
 PROIBIDA REPRODUÇÃO SEM CITAÇÃO DO AUTOR E FONTE
 

Identificação do material colhido:
 
Material sem identificação não têm nenhum valor e é desprezado. Devem constar da identificação do material:
 

1.     Identificação do paciente (espécie, raça, nome, idade e sexo);
2.     Procedência e suspeita;
3.     Local da biópsia;
4.     Modo de obtenção (punch, biópsia incisional, biópsia excisional, peça cirúrgica);
5.     Laudo anatomopatológico;
6.     Número de amostras coletadas;
7.     Informes clínicos.

 
Identificação do material (rótulo) deverá ser feita com lápis que não borra no caso de umedecimento acidental do rótulo. Deixar claro na embalagem mais externa o indicativo de material biológico com possível contaminação. Para colheita, armazenamento e remessa das amostras (frascos, plásticos e outros) utilizar sempre embalagens limpas e secas. Prevenir vazamento (lacrar com fita adesiva) e perda de material e inutilização do laudo e da identificação. 

 
Todas as amostras deverão ser colhidas no menor espaço de tempo após o óbito do animal.  Na dúvida, refrigeração (entre 1 e 50 C) é a melhor forma de armazenamento para diversas finalidades (exames),  mas apenas por períodos reduzidos. A refrigeração permite o uso posterior de outros conservadores. O uso de seringas estéreis e descartáveis constitui uma forma simples e prática de coleta e armazenamento por tempo limitado de amostras.

 
Material na necropsia pode ser colhido para:
 

•     Histopatologia
•     Citologia
•     Imunohistoquímica
•     Microscopia eletrônica
•     Microbiologia
•     Parasitologia
•     Sorologia
•     Toxicologia
•     Hematologia
•     Urinálise
•     Identificação de células e sedimentos
•     Diagnóstico Molecular

Histopatológico

Durante necropsia retirar três ou mais fragmentos da lesão (região central e do limite da lesão junto com o limite da área não afetada-área de transição) de 0,5 a 1,0 cm de espessura e acondicionar em frasco de boca larga em formol tamponado neutro 10%. No caso de órgãos tubulares retirar um fragmento que inclua a circunferência completa, um anel, de amostra. Tomar cuidado para não comprimir ou esmagar o tecido. O volume do formol deverá ser no mínimo dez vezes o volume dos fragmentos e de preferência preencher todo o frasco. Envolver os tecidos que tendem a flutuar (pulmão, medula óssea) com gaze ou algodão. O tempo de fixação é de 1 a 2 horas para cada milímetro de espessura do tecido. Para transporte excesso de formol pode ser descartado somente após 24 horas de fixação para amostras menores de 3 cm e 48 horas para maiores de 3 cm (SNC). Congelamento de amostras impede a obtenção de secções histológicas adequadas para exame.

Biópsias

Para obtenção de biópsias retirar fragmentos com no mínimo 0,3 cm de espessura e 0,4 cm de profundidade de preferência  do limite da lesão contendo tanto a lesão como a área não afetada. Nas biópsias por excisão (exérese de toda a lesão) de neoplasias cutâneas incluir margens de segurança com no mínimo 0,2 cm na biópsia para permitir a correta secção dos fragmentos e avaliação adequada das margens da lesão, particularmente quanto á invasividade da neoplasia.

Para preparar um litro de solução de formol a 10%, use 100 ml de formaldeído (35-40%) e 900 ml de água de torneira.
Existe uma confusão freqüente entre aldeído fórmico (ou formaldeído) e formalina comercial (ou formol). Formaldeído é um gás com o qual se prepara uma solução aquosa 35-40%. Esta solução constitui a formalina comum. O termo formalina refere-se, portanto, à apresentação comercial da solução de formaldeído. Assim, formol (ou formalina) a 10% representa uma solução preparada misturando-se 10 ml de formalina comercial (formaldeído 35-40%) com 90 ml de água.

 
O formol tamponado fornece uma fixação com resultados melhores, mas não é essencial pois permite um exame histológico aceitável. O formol não tamponado leva á formação de hematina (pontos escurecidos, particularmente em vasos sanguíneos), um artefato de técnica.

FORMALINA TAMPONADA pH = 7,0

Formaldeído 40%*        550 ml      (100 ml)
Na2HPO4 (anidro)         32,5 g         (6,5 g)
NaH2PO4.H2O              20,0 g            (4 g)
Água destilada            4500 ml       (900 ml)
TOTAL                          5 litros         1 litro

 
Coleta de amostras do SNC

Recomendações gerais: as doenças do sistema nervoso central (SNC) frequentemente não apresentam lesões óbvias á necropsia. Por este motivo, o histórico clínico e a coleta adequada de amostras para exames complementares se tornam imprescindíveis.

Observações específicas:

•     Se o material for destinado ao exame histológico, é extremamente importante que o manuseio do tecido nervoso ainda não-fixado seja o mínimo possível. O manuseio do tecido nervoso não-fixado causa artefatos que prejudicam a avaliação histológica das lesões.
•     Para histopatologia, de forma ideal todo o encéfalo deverá ser imerso em formol e a secção para obtenção de fragmentos realizada 24 horas após a fixação inicial. Pode-se utilizar formol a 20% para o SNC.
•     Tanto quanto possível, o exame macroscópico sistemático do encéfalo deve ser feito no órgão já fixado no formol. Isso facilita a seleção de áreas apropriadas para o diagnóstico de doenças específicas e permite que se determine a distribuição das lesões (i.e. bilatérias, simétricas, focais, multifocais, na substância branca, na substância cinzenta).
•     O material para exames virológicos e bacteriológico deve ser colhido antes da fixação do encéfalo no formol. Por outro lado, o congelamento torna o encéfalo inadequado para o exame histológico. Como muitos casos necessitam dos três tipos de exame, um meio termo deve ser alcançado.
•     Para bacteriologia e/ou virologia resfriar ou congelar: fatia de 0,5 cm de espessura do cerebelo, 2,5 cm da medula cervical, 1 cm do tálamo, metade caudal de um dos hemisférios telencefálicos, para raiva adicionar o gânglio trigeminal.
•     Para diagnóstico de raiva (imunofluorescência prova biológica-inoculação em camundongos ou células) o material a ser enviado deverá ser refrigerado acondicionado em frasco com tampa ou dupla embalagem plástica, hermeticamente fechado e colocado em caixa isotérmica contendo gelo reciclável para manter a temperatura de 2 a 4 C0. A embalagem externa deverá ter um símbolo de risco biológico e uma etiqueta com os dizeres: URGENTE, MATERIAL BIOLÓGICO PERECÍVEL. Sobre a tampa deverá ser afixado o formulário único de requisição dos exames para síndromes neurológicas preenchido. A amostra deve ser enviada ao laboratório preferencialmente até 24 horas após a colheita. O laboratório deverás ser previamente informado do envio e horário de chegada da amostra. O material só deverá ser congelado se o tempo destinado ao envio for muito longo (acima de 48 horas).  Reter amostras do SNC para exame histopatológico. A retirada do SNC para exames laboratoriais está detalhado nos manuais do Ministério da Agricultura. Na dúvida refrigerar e encaminhar a metade do SNC para exame de raiva e fixar a outra metade em formol para exame histopatológico.

 
Citologia

O exame citológico apresenta como característica principal a rapidez do diagnóstico, quando comparado ao exame histopatológico e por necessitar de pequena quantidade de material. Sua desvantagem é não permitir a visualização da arquitetura do órgão e, portanto, deve ser considerada uma tentativa de antecipar o diagnóstico. É indicada particularmente para diferenciar processos inflamatórios agudos ou crônicos e neoplásicos benignos e malignos.

Utilizar sempre lâminas limpas e desengorduradas em álcool comum. Após a colheita do material as lâminas devem ser fixadas ao ar, conservadas em temperatura ambiente, identificadas em adesivo ou esparadrapo e enviadas ao laboratório em no máximo 48 horas juntamente com as informações relacionadas. Se houver demora maior para o envio, fixar o material em álcool metílico ou metanol por 3 a 5 minutos.

Métodos: punção aspirativa, impressões (claps ou imprints) e esmagamento (squash).

Para imprints colher um fragmento de 1-2 cm do órgão ou nódulo a ser examinado, fazer várias impressões preliminares sobre um papel toalha para retirar o excesso de sangue e em seguida fazer a impressão sobre a lâmina. A técnica do esmagamento consiste em colocar uma lâmina sobre a outra perpendicularmente e comprimir e espalhar entre elas uma amostra de 0,2 cm do material a ser examinado, como em um esfregaço.

 
Imunohistoquímica
Fragmentos de 5 mm fixados 8 a 12 horas em formol tamponado e depois armazenados em álcool 700 GL.

 
Microscopia eletrônica
Fixação de fragmentos diminutos em glutaraldeído 3%

 
Microbiológico
Material pode ser coletado de animais vivos ou recentemente mortos e e remetidas ao laboratório resfriados (caixas de isopor com gelo). É aconselhável obter amostras das bordas das lesões onde a multiplicação bacteriana é mais ativa. Os espécimes devem ser coletados em assepsia estrita, para evitar contaminação. Amostras de animais com tratamento recente com antibióticos têm pouco valor no isolamento de bactérias. Sempre que possível deve ser enviado ao laboratório quantidade satisfatória de material como vários milímetros de pus, exsudato, fezes ou sangue. De abscessos coletar pus da periferia, o centro é muitas vezes estéril. Sugerimos para tal utilizar seringas descartáveis estéreis e eventualmente acondicionar depois o material em frascos estéreis. O envio de material em zaragatoa (swab) estéril contactadas com secreções suspeitas e imediatamente acondicionadas em recipiente estéril (tubo) pode ser utilizado mas o material desseca tornando inviáveis vários patógenos. Fragmentos de tecidos podem ser colhidos em com auxílio de instrumentos estéreis e cuidados descritos anteriormente.

Para cultura de anaeróbios: muito cuidado pois não sobrevivem mais de 20 minutos à exposição ao oxigênio. A coleta não deve ser feita após quatro horas da morte do animal por causa da rápida invasão de microorganismos anaeróbios do trato intestinal. Zaragatoas não prestam para o isolamento de microorganismos anaeróbios. Enviar blocos de 4 cm3 em frascos estéreis ou líquidos na própria seringa inicialmente estéril e sem ar. Em doenças sistêmicas pode ser coletado osso do animal (úmero ou fêmur) de preferência sem os tecidos moles. Em casos de enterotoxemia pode ser coletado um segmento de 30 a 40 cm do íleo fechado nas extremidades com barbante.

 
Virologia
Coletado apenas em animais recentemente mortos e em material resfriado (em cama de gelo) alternativamente imerso em solução aquosa (água destilada) de glicerina a 50%. Espécimes fixados por acetona, éter, formalina e outros não são utilizáveis para o isolamento viral.

 
Sangue
Para obtenção de soro, hematologia ou hemocultura: sangue deve ser puncionado diretamente do coração, antes da abertura do mesmo, com agulha e seringa esterilizadas (sem anticoagulante para bacteriologia e provas sorológicas, heparinizado para virologia). Possível apenas em animal recém-morto.

 
Urina
Para exame do sedimento e cultura: colhida por cateterismo ou punção da bexiga com agulha e seringa esterilizadas. Se a suspeita for leptospirose, alcalinizar a urina com bicarbonato de sódio para facilitar a preservação das leptospiras.

 
Líquido cefalorraquidiano (líquor)
Para isolamento de microorganismos colhido assepticamente no espaço lombossacral com agulha de 6 a 8 cms. O local de coleta deve ser previamente lavado com água e sabão e feita a assepsia com álcool 70%. Um volume de 5 ml deve ser coletado. Pela ausência de nutrientes os microorganimos permanecem viáveis por pouco tempo no líquor. Por este motivo à amostra deve ser enviada ao laboratório com urgência. Citologia pode também ser realizada com líquor.

Fezes
Colhidos diretamente do reto ou imediatamente após defecação da porção central do bolo com uma espátula. Para exame bacteriológico coletar no mínimo dois gramas.

 
Leite mamítico ou não
Assepsia prévia das tetas  e mão do ordenhador (lavar com água e sabão e depois desinfetar com álcool 70%) e uso de frasco esterilizado para cada teta. Desprezar os jatos iniciais.

 
Feto abortado
Remete-lo resfriado junto com a placenta

 
Ossos
Metacarpianos ou metatarsianos desarticulados e descarnados de animal recém-morto, acondicionado em saco plástico e gelo ou em pacotes com cal, sal ou cinza. O osso não deve ser quebrado ou serrado, pois a exposição da medula leva a contaminações secundárias.

Raspado de pele:
Para pesquisa de ectoparasitos e fungos deve-se fazer uma boa assepsia no pêlo do animal utilizando álcool 700 (não esfregar) devido á presença de microorganismos saprófitos que podem interferir no resultado do exame;
Para colheita de material de pele em animais de pêlos longos, realizar tricotomia parcial, deixando os pêlos com no máximo 0,5 a 1,0 cm de comprimento. Incluir na amostra pêlos partidos associados á lesões, pêlos íntegros retirados do centro dos folículos com pinça hemostática, unhas e descamação;
O raspado deve ser profundo e realizado na periferia da área lesionada quando esta for descamativa. Quando a suspeita é de sarna demodécica, deve-se comprimir fortemente a pele com os dedos para remover com a amostra os ácaros que se localizam profundamente na pele. No caso de micose, arrancar pêlos da periferia da lesão junto com o raspado.
Obter raspados de diversas lesões utilizando lâmina de bisturi
As amostras podem ser armazenadas em frascos ou placas de Petri bem vedados ou em uma lâmina limpa, cobrir com outra lâmina fixando as duas com esparadrapo.

Exame toxicológico
Enviar no mínimo 100gr das seguintes amostras de acordo com a suspeita resfriados (em gelo) ou congelados no interior de sacos plásticos ou frascos bem limpos:
 

•     Estômago, fechado com ligaduras á altura do cárdia e piloro;
•     Intestino delgado e grosso devidamente ligados (inteiros ou segmentos);
•     Fígado, baço, coração e vasos da base; pulmões; rins, cérebro e medula, músculos e sangue (5 ml) com anticoagulante-heparina  (1mg/5 ml), uma vértebra;
•     Bexiga, devidamente ligada na uretra proximal e ureteres ou 50 ml de urina

 As amostras não devem ser lavadas para evitar perda de substâncias ou contaminação. Suspeita(s) da(s) substância(s) química(s) responsáveis pela intoxicação/envenenamento devem ser relatadas.  Havendo envolvimento judicial, as embalagens devem ser lacradas sob visão de testemunha para o envio.

 100 gr de ração milho ou feno com suspeita de contaminação devem ser enviados refrigerados ou congelados.

Exame botânico
No caso de suspeita de intoxicações botânicas.  Pesquisar no conteúdo gastrintestinal partes não digeridas e sementes das plantas. Procurar no pasto ou ambientes em geral plantas suspeitas. No caso de plantas de pequeno porte retirar toda a planta (raiz, caule, folhas, flores e frutos). Das plantas de porte maior colher ramos de 20 a 30 cm com folhas, frutos, flores e sementes. Desidratar  e prensar o material em folhas de jornal sob peso (pilhas de livros) por dois dias e trocando o 5 a 6 vezes. Enviar as amostras secas em jornal recoberto com papelão grosso.

 
Molecular (PCR)
-70 0C, em nitrogênio líquido, resfriado, álcool 70% ou álcool isopropílico

Doenças específicas
Leishmaniose visceral canina: diagnósticos por sorologia, exame parasitológico por observação direta do parasita e reação em cadeia da polimerase (PCR).
 

1.     Sorologia: limitados a estudos epidemiológicos pela presença de falsos positivos e não distinção de animais vacinados de doentes;
2.     Exame parasitológico: exame citológico com pesquisa de Leishmania em aspirado de medula óssea, de linfonodos ou baço. Na prática linfonodos são mais usados;
3.     Amostras: punção de linfonodo (material de eleição), medula óssea (volume total do aspirado), 5 ml de sangue total em EDTA (não colher em heparina pois inibe o PCR), punção esplênica e hepática, material de biópsia. Enviar material em tubo ou frasco estéreis. Material de biópsia deve ser imerso em solução fisiológica estéril, congelado e enviado em gelo seco em até 48 horas após a coleta. Sangue periférico pode ser mantido refrigerado e exsudatos em lâminas á temperatura ambiente.

 
Clostridioses (Lobato et al., 2006): deve-se proceder á necropsia pouco tempo após a morte do animal, ou, de preferência, quando o animal ainda está em estado agônico, pois a maioria dos clostrídeos invadem a carcaça rapidamente após a morte, mascarando o quadro. Materiais de eleição e técnicas utilizadas no diagnóstico estão discriminados na tabela a seguir.
 

Tabela. Materiais de eleição e critério diagnóstico das clostridioses animais

Bibliografia
 
Anilton César Vasconcelos. Necropsia e conservação de espécimes para laboratório. Cadernos técnicos da Escola de Veterinária da UFMG, n.16. p1-86, julho, 1996.

Barros, C. S.L.; Marques, G.H.F.M., 2004. Procedimentos para o diagnóstico das doenças do sistema nervoso Central de bovinos. MAPA/DAS/DDA pp.48.

Controle da raiva dos herbívoros. Manual técnico-2005. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Pp.103.

Instituto Hermes Pardini, Divisão Veterinária – folhetos explicativos

Lobato, F.C.F.; Assis, R.A.; Salvarani, F.M., 2006. Principais clostridioses na bovinocultura leiteira. Revista técnica de bovinocultura de leite. Ano 1- número 3, junho de 2006, p. 38-44.

Sartin, E.A.; Spano, J. S.; Hathcock, T.L., 1999. A practitioner`s guide to necropsy. Compendium (small animal/exotics). October, 21 (10): 954-960.

PROIBIDA REPRODUÇÃO SEM CITAÇÃO DO AUTOR E FONTE

NORMAS GERAIS DE BIOSSEGURANÇA
RELACIONADAS AO LABORATORISTA/DISCENTE

1. USAR OBRIGATORIAMENTE MACACÃO, DE PREFERÊNCIA
BRANCO, BOTAS; LUVAS SOBRE AS MANGAS;

2. AO USAR LUVAS NÃO MANUSEAR OUTROS OBJETOS DE
USO COMUM, TAIS COMO TELEFONES, MAÇANETAS E
TORNEIRAS; DESCARTÁ-LAS APÓS O USO EM LOCAL
APROPRIADO DENTRO DA SALA DE NECROPSIA;

3. NÃO COMER, NÃO BEBER E NÃO FUMAR;

4. USAR ÓCULOS DE PROTEÇÃO NA ÁREA DE TRABALHO;

5. NÃO SENTAR SOBRE BANCADAS, PIAS; ENCOSTAR-SE EM
PAREDES E OUTROS LOCAIS PROVÁVEIS DE
CONTAMINAÇÃO; NÃO SAIR DO LABORATÓRIO DURANTE
NECROPSIA;

6. Não manusear ou armazenar alimentos, principalmente goma
de mascar;

7. Manter cabelos curtos ou presos, as mãos longe dos olhos,
nariz e boca e lavá-las antes de entrar e após sair do
laboratório; NÃO ENTRAR NO VESTIÁRIO COM LUVAS
(PODE CONTAMINAR AS TORNEIRAS);

8. Evitar maquiagens e adornos; roupas de lã, veludo, e outros
tecidos de fibras grossas, pois liberam e absorvem milhares de
partículas e germes contaminando o usuário e o ambiente;

9. Todos os objetos, INCLUSIVE ROUPAS, usados dentro do
laboratório como canetas, lápis borrachas etc não devem ser
usados fora das dependências do laboratório;

10. Cobrir cortes e ferimentos antes de manusear qualquer
espécime dentro do laboratório;

11. Não colocar material contaminado em geladeiras, armários e
gavetas não apropriados para isso; não colocar material de uso
diário dentro do laboratório;

12. O laboratorista (discente) deve receber as imunizações viáveis
para os agentes manipulados ou potencialmente presentes no
laboratório.

O NÃO CUMPRIMENTO DAS NORMAS IMPLICA EM RISCO PARA
O INGRESSANTE E OS RESPONSÁVEIS PELO LABORATÓRIO
PODEM RESTRINGIR O INGRESSO

BIBLIOGRAFIA

Chaves Borges, F.A., Mineo, J.R. Medidas de Biossegurança em laboratórios. UFU. 1997.
World Health Organization. Laboratory biosafety manual. 2ª. 2003